Discurso de la profesora Margarita Salas Falgueras

Con motivo de su investidura como Doctora Honoris Causa en Ciencias por la UNED

Gracias a todos los miembros de dicho Departamento, y al profesor Antonio Zapardiel Palenzuela, Decano de la Facultad de Ciencias por la ama-bilidad de su Junta de Gobierno de hacer la propuesta de mi persona a la Universidad, y gracias al Claustro de la Universidad por haber aceptado tal propuesta.
No quiero en estos agradecimientos olvidar a mi querida y entrañable amiga Consuelo Boticario, profesora del Departamento de Ciencias Analíticas y Directora del Centro asociado a la UNED en Plasencia, por haber tenido la iniciativa y sugerir la idea de que fuéramos dos discípulos de Severo Ochoa los protagonistas de este Solemne Acto. Muchas gracias Consuelo.

Mi vida como profesional investigadora se puede dividir en los dos períodos o etapas que ha comentado el Profesor Durand en la presentación que acabamos de escuchar. Voy a resumirles mis vivencias científicas de estos 50 años de dedicación a la ciencia, unidas a aquellas personas que me han acompañado y han participado en las tareas científicas en el devenir de cada día en el laboratorio. De éstos, 40 van unidos a Eladio Viñuela con quien compartí este período importante de nuestras vidas.

Después obtener el título de Doctor dirigidos por Alberto Sois, y después de tres años en los Estados Unidos en el laboratorio del Profesor Severo Ochoa, Eladio y yo decidimos volver a España, organizar nuestro propio laboratorio en el Centro de Investigaciones Biológicas de Madrid, crear un grupo de investigación, después de elegir un tema donde pudiéramos desarrollar nuestros conocimientos sobre Biología Molecular, adquiridos en el laboratorio de Severo Ochoa. Un curso al que habíamos asistido el verano anterior, en los laboratorios de Cold Spring Harbor, sobre virus bacterianos, nos vino a marcar el rumbo de nuestro futuro trabajo. El estudio de estos virus, también denominados bacteriófagos, había dado lugar al nacimiento de la Genética Molecular. Así pues, elegimos como sistema de estudio un bacteriófago, poco conocido entonces, de tamaño relativamente pequeño, pero de compleja morfología, el bacteriófago 029 que infecta a la bacteria Baciffus subtilis, cuyo DNA lineal de doble cadena tiene un tamaño de 19.000 pares de bases, unas 10 veces más pequeño que el fago mejor conocido, el T 4 del Escherichia cofi, con cuyo estudio ya se habían realizado grandes avances en Biología Molecular. El ser estructuralmente complejo y estar formado por cabeza, cuello y cola, hacía que el fago 029 fuera un modelo muy atractivo desde el punto de vista de la morfogénesis de la partícula vírica, pues nos permitía estudiar cómo se ensamblaban las distintas proteínas para dar lugar al virus maduro.

Una vez elegido el tema de nuestro trabajo científico, nos encontramos con el primer problema. En aquella época, en 1967, no existía ningún tipo de financiación estatal para realizar investigación científica. Por eso, tuvimos que solicitar una ayuda americana, a la Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research, que nos fue concedida gracias al apoyo de Severo Ochoa. Esta financiación fue esencial para nuestros comienzos en España. El Centro de Investigaciones Biológicas, a su vez, nos proporcionó un laboratorio y así fue como comenzamos nuestra andadura científica. Por otra parte, tuvimos la suerte de que a finales de 1967 se convocaron las primeras becas del Plan de Formación de personal Investigador, lo cual nos proporcionó nuestros primeros becarios predoctorales.
Enrique Méndez fue nuestro primer doctorando, y con él iniciamos el estudio de la estructura de la partícula vírica, a la que antes me he referido, y la caracterización de las diferentes proteínas que forman las estructuras del fago. Esto dio lugar a la primera publicación de nuestro nuevo grupo, en la revista Virology, y también a la primera Tesis Doctoral.
En paralelo, con Antonio Talavera primero y después con Felipe Moreno, Ana Camacho y Rafael Pérez Mellado, iniciamos el estudio de la genética del fago con el aislamiento de mutantes letales condicionales, sensibles a temperatura y sensibles a supresor. Esto llevó al estudio de la morfogénesis de la partícula vírica por Fernando Jiménez, Ana Camacho, José L. Carrascosa y Nieves Villanueva. Lo más relevante de estos resultados fue descubrir la existencia de unas proteínas morfogenéticas, que forman parte transitoriamente de la partícula vírica, pero que no están presentes en el fago maduro.
Por otra parte, con Jesús Ávila, iniciamos el estudio de la transcripción del DNA del fago mediante la purificación y caracterización de la RNA polimerasa de la bacteria hospedadora, Bacillus subtilis. Posteriormente, con José Miguel Hermoso demostramos la existencia de un control temporal en la transcripción del DNA del virus. Así, hay genes tempranos que se expresan al comienzo de la infección y genes tardíos que se transcriben posteriormente, pero que requieren para su expresión la intervención de un gen temprano, el gen 4.
Con Marta Rodríguez Inciarte y José María Lázaro, utilizamos por primera vez en España una nucleasa de restricción, la EcoRI, consiguiendo con ella el primer mapa en el que se establecía una correlación entre el mapa físico y el genético del fago ø29..
La llegada de la Ingeniería Genética nos abrió nuevos horizontes para proseguir el estudio del fago 029. Por un lado, el clonaje de genes para la sobreproducción de las proteínas correspondientes, y por otro la mutagénesis dirigida para estudiar la correlación entre estructura y función. Así, clonamos el gen 4 y una vez producida la proteína p4 en elevadas cantidades, conseguimos purificarla y desarrollamos un sistema de transcripción in vitro en el cual se requería la proteína p4 para la transcripción del promotor tardío en presencia de la RNA polimerasa de Bacillus subti/is. De esta manera pudimos demostrar que p4 era un activador transcripcional que se une a una secuencia invertida del ONA y al unirse ocasiona un aumento en la curvatura del propio DNA. Esta mayor curvatura, así como los contactos directos entre p4 y la RNA polimerasa son necesarios para la activación del promotor tardío. Posteriormente pudimos demostrar que la misma proteína p4, que activa la transcripción tardía, actúa, a su vez, como represor de dos promotores tempranos, A2b y A2c. Por otra parte, la proteína vírica temprana, producto del gen 6, que se requiere para la iniciación de la replicación del DNA del virus, también coopera con la proteína reguladora p4 en la activación del promotor tardío A3 y en la represión de los promotores tempranos antes citados. Así pues, el sistema de regulación de la expresión del DNA del fago, es un sistema complejo que puede servir como modelo de mecanismo de control de la expresión genética. Quiero citar aquí, entre otros, a Isabel Barthelemy, Fernando Rojo, Beatriz Nuez, Mario Mencía, María Monsalve, Ana Camacho, Belén Calles, Monstserrat Elías-Arnanz y Laura Pérez. En estudios posteriores, en colaboración con el grupo dirigido por Miquel ColI, en el Instituto de Biología Molecular del CSIC en Barcelona, hemos conseguido la estructura tridimensional de la proteína p4, así como la estructura de esta proteína unida al DNA, lo que nos ha abierto nuevos caminos para profundizar en las interacciones que tienen lugar entre la proteína p4 y el DNA.
 

El estudio de la replicación del DNA de ø29. surgió como consecuencia de los experimentos de Juan Ortín, quien descubrió una proteína unida covalentemente a los extremos 5' del DNA que daba lugar a formas circulares que se convertían en DNA lineal de longitud unidad por tratamiento con enzimas proteolíticos. Por microscopía electrónica José Manuel Sogo pudo visual izar dicha proteína en los dos extremos del DNA del fago. A esta proteína, producto del gen 3 vírico, la denominamos proteína terminal.

También por microscopia electrónica caracterizamos los intermediarios replicativos en bacterias infectadas por ø29. y llegamos a la conclusión de que la replicación se inicia en los extremos del DNA por un mecanismo de desplazamiento de cadena. Más tarde, Miguel Ángel Peñalva demostró que la iniciación de la replicación del DNA del fago tiene lugar utilizando la proteína terminal como "primer". Esto ha supuesto el descubrimiento de un nuevo mecanismo para la iniciación de la replicación de genomas lineales. Las dos proteínas esenciales para la iniciación de la replicación del DNA de ø29.  son la proteína terminal y la DNA polimerasa del virus, que forman inicialmente un heterodímero, y cuyos genes fueron clonados en Escherichia coli para la sobreexpresión de las proteínas por Juan Antonio García y Luis Blanco, respectivamente. Estas dos proteínas, una vez iniciada la replicación se separan, quedándose la proteína terminal unida covalentemente al DNA, y la DNA polimerasa prosigue la replicación dando lugar in vitro a DNA de ø29.  de longitud unidad de un modo muy procesivo. Esto quiere decir que la DNA polimerasa, una vez que inicia la replicación de una cadena de DNA, continúa hasta el final, sin pararse ni disociarse. Además, la DNA polimerasa tiene una actividad intrínseca de desplazamiento de cadena. Estas propiedades de la DNA polimerasa de ø29, caracterizadas por Luis Blanco, así como su fidelidad, han sido la base para su aplicación biotecnológica en la amplificación del DNA.

Cristina Garmendia realizó los primeros estudios de mutagénesis dirigida en la proteína terminal de ø29 y después Luis Blanco, Antonio Bernad, María Antonia Blasco, Miguel de Vega, Irene Rodríguez y otros doctorandos lo hicieron en la DNA polimerasa en estudios de correlación estructura y función.

Recientemente, en colaboración con el grupo de Tom Steitz de la Universidad de Yale, se ha determinado la estructura tridimensional de la DNA polimerasa de ø29, así como la del heterodímero DNA polimerasa/proteína terminal, siendo la primera vez que se determina la estructura de una polimerasa que utiliza una proteína terminal como iniciadora. Esto nos ha permitido profundizar en el estudio de la correlación de estructura y función, en particular determinar la estructura responsable de las propiedades de procesividad y desplazamiento de banda de la DNA polimerasa de ø29, que son únicas para esta polimerasa.

Por otra parte, Gil Martín y Crisanto Gutierrez iniciaron el estudio de otra proteína implicada en el proceso de replicación, la 5, caracterizada como la proteína de unión al DNA de la cadena simple desplazada en los intermedios replicativos del DNA de ø29.

Me quiero referir de nuevo a la proteína p6 que se une a los orígenes de replicación del DNA de ø29 formando un complejo nucleoprotéico cuyo estudio inicial fue realizado por Ignacio Prieto y Manuel Serrano. Esta proteína estimula la iniciación de la replicación, favoreciendo la apertura de los extremos del DNA. De acuerdo con esta idea, se ha obtenido replicación in vitro de DNA de cadena simple, lo que llevó a Juan Méndez a demostrar que la replicación se inicia en la timina que ocupa la segunda posición desde el extremo 3' y no en la timina que ocupa la primera posición. Esto, unido al requerimiento de una reiteración terminal de al menos dos nucleótidos, nos ha llevado a postular un nuevo mecanismo que hemos denominado de deslizamiento hacia atrás, o "sliding-back". Este modelo tiene implicaciones importantes para mantener intactos los extremos del DNA ø29. Nosotros proponemos que este modelo puede extrapolarse a otros DNAs que utilizan proteína terminal, pues en todos estos casos existe reiteración en los extremos del DNA.

Otras dos proteínas víricas que se requieren en la replicación del DNA de ø29, la p1 y la p16.7, cuyo estudio iniciaron Alicia Bravo y Wilfried Meijer, respectivamente, son proteínas de membrana que intervienen en la localización del DNA del virus y de los intermediarios replicativos en la membrana bacteriana. Otra proteína vírica, la p56, estudiada por Gemma Serrano y posteriormente por Laura Pérez, interacciona con la uracil-DNA glicosilasa bacteriana y evita la inestabilidad del DNA de ø29 cuando se incorporan residuos de uracilo al mismo. Laura Mojardín estudia en la actualidad las posibles aplicaciones biotecnológicas de esta proteína.
También quisiera destacar el papel de proteínas de Bacillus subtilis, como las del citoesqueleto, que se requieren para la replicación del DNA de ø29, de acuerdo con el estudio de Daniel Muñoz, o la proteína SpoOA, estudiada por Wilfried Meijer y Virginia Castilla, que interfiere con la replicación y la transcripción del DNA de ø29 en bacterias que empiezan la fase de esporulación.

Por último, quisiera acabar con un aspecto práctico del sistema de replicación in vitro del DNA de ø29 que da lugar a amplificación del DNA. En presencia de las cuatro proteínas de replicación esenciales, la proteína terminal, la DNA polimerasa, y las proteínas p5 y p6, cantidades pequeñas de DNA ø29 se amplifican más de 1000 veces dando lugar a la síntesis in vitro de DNA de unidad de longitud. El DNA amplificado in vitro es tan infectivo como el DNA aislado de partículas virales cuando se transfectan células competentes de Bacillus subtilis. Esto podría ser la base para un sistema de amplificaciónn in vitro usando los orígenes de replicación y las proteínas de replicación de ø29.
Por otra parte, la actividad de apertura de la doble hélice de la DNA polimerasa de ø29, unida a su procesividad y a su capacidad de corrección de errores de replicación, han dado lugar a una aplicación biotecnológica de la DNA polimerasa de ø29 con unos excelentes resultados en la amplificación del DNA circular con iniciadores múltiples mediante el mecanismo llamado de la rueda giratoria. Posteriormente, se extendió la aplicación biotecnológica a la amplificación de DNA lineal, de DNA genómico. Más recientemente, Miguel de Vega ha construido DNA polimerasas de ø29 quiméricas a las que ha añadido dominios de unión a DNA que mejoran la capacidad de amplificación de la DNA polimerasa original, y José Ma Lázaro ha desarrollado nuevas condiciones que permiten la amplificación de 1000 veces menos cantidad de DNA respecto a las condiciones existentes. Ambas mejoras han dado lugar a la presentación de 2 nuevas patentes. Más recientemente, Mario Mencía ha desarrollado un nuevo sistema de amplificación de DNA usando los orígenes de replicación del DNA de ø29 y la proteína terminal como iniciadora.
Quiero resaltar el hecho de que de los hallazgos en temas fundamentalmente básicos como los que les acabo de mostrar, pueden derivarse aplicaciones de gran interés, tal como la DNA polimerasa de ø29, cuyas propiedades de procesividad y desplazamiento de cadena son muy apropiadas para su aplicación en biotecnología, concretamente para la amplificaciónn de DNA.

También quiero hacer notar que nuestros descubrimientos con el DNA de 029 son extrapolables a otros virus de interés sanitario y económico, como el adenovirus humano, que produce transformación oncogénica, el virus de la poliomielitis, el de la encefalomiocarditis, los virus de la hepatitis B y C y una gran variedad de virus de plantas.

Hemos recorrido un largo camino desde que Eladio y yo iniciamos nuestra andadura en Biología Molecular cuando volvimos a España en 1967. La Biología Molecular se ha desarrollado desde entonces de una manera espectacular. Existen hoy grupos de investigación de indudable calidad en España, pero todavía es necesario potenciar la cantidad, en particular recuperando jóvenes investigadores excelentemente preparados.
Finalmente, quiero poner de manifiesto, que el resumen de mis vivencias científicas, que acabo de mostrarles son el resultado de la continua dedicación de muchas personas que han colaborado en el grupo del fago 029, a lo largo de los cuarenta y tres últimos años. Muchas de estas personas tienen hoy en día sus propios grupos y se encuentran realizando investigación de excelencia. Mi más profundo agradecimiento y afecto a todas ellas, yen particular a las que se encuentran conmigo en este momento y colaboran día a día con su esfuerzo y entusiasmo en la buena marcha del grupo: Miguel de Vega, José María Lázaro, Ana Camacho, Mario Mencía, Daniel Muñoz y todos los doctores, estudiantes de doctorado y técnicos. Quiero hacer una mención especial a dos personas: José Ma Lázaro, quien trabaja conmigo desde el año 1972 y representa la memoria histórica científica del grupo, y María Ángeles Villarraso quien desde hace 14 años me ayuda y es para mí un verdadero ángel de la guarda.
Mi agradecimiento a mis dos maestros de la etapa pre- y post-doctoral, Alberto Sois y Severo Ochoa, respectivamente, quienes me enseñaron no solo la Bioquímica y la Biología Molecular, sino también la rigurosidad experimental, la dedicación y el entusiasmo por la investigación.
Por último, mi agradecimiento a mis familiares más cercanos, mi madre, mi hija Lucía y mi hermana Marisa. Mi recuerdo a mi padre y a mi hermano Pepe, que ya nos dejaron, a quienes el Doctor Durand ha recordado de manera entrañable. De manera muy especial quiero dedicar un emocionado recuerdo a Eladio con quien compartí los momentos más importantes de mi vida. Tener a Eladio a mi lado ha sido para mí un estímulo constante. Su consejo siempre acertado ha estado apoyándome continuamente. Eladio ha sido, no solo mi marido y mi amigo. sino también el mejor de mis maestros.
Ciertamente, sin su ayuda, apoyo y estímulo constantes no estaría hoy aquí recibiendo este Doctorado Honoris Causa por la Universidad Nacional de Educación a Distancia.

Muchas gracias.

Madrid, marzo 2011