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LINES OF RESEARCH


(in collaboration with other members of the research group)

A. MOLECULAR AND CELLULAR ECOTOXICOLOGY IN INVERTEBRATES

Two of the most important environmental problems at the present time are climate change and pollution of ecosystems. Human activities have modified our environment, which also affects other organisms. Invertebrates are animals that lack a backbone and encompass most of the known animal species. Their role in an ecosystem is basic and they appear practically everywhere in the planet. On the other hand, because they are very diverse their response to changes in the environment is very variable. Toxicology is the scientific area that studies the effect of toxic agents, both physical and chemical, on living organisms. It also analyzes the behavior of chemical compounds in the different compartments of the ecosystem. Using a molecular and cellular level approach I study the effect of multi-stress, that is, the response of different species of invertebrates to chemical stress (pollutants) and environmental stress (temperature, pH, humidity). The species I study are Chironomus riparius (an insect), Physella acuta (a mollusk), and Eisenia fetida (an annelid). The first two are organisms that spend most of their lives in the water while E. fetida is a species of earthworm. Chironomids are a group of widely distributed dipteran that are mostly found in inland waters, although there are representatives of marine life. Within its life cycle, the larval period is the longest and develops in the sediments of rivers, lakes and other continental waters. Both characteristics, wide distribution and benthonic character, make them ideal for the analysis of the effects of contaminating compounds in aquatic ecosystems and the search for useful molecular biomarkers for the protection of the environment. P. acuta is an easily cultivable hermaphroditic snail found in Europe and North America. Its life cycle lasts approximately two years, reaching maturity two to three months after hatching. E. fetida is an earthworm that is commonly used in toxicity studies. It is also used in vermicomposting. From the cocoons that form the juveniles they grow up to adults once they develop the clitellum.

Among the compounds that are discharged into the environment there is great diversity, so it tends to group them well depending on the effects they have (for example, endocrine disruptors) and / or their structure (for example, polyphenols). Among the compounds I am studying are fungicides (vinclozolin), plasticizers (bisphenol A), ultraviolet filters (benzophenone-3) or heavy metals (cadmium). Both isolated effects and mixtures of these compounds are analyzed. As environmental agents that alter the effect of chemical compounds, temperature is the main factor studied.

Molecular and cellular effects are mainly studied through the analysis of gene expression by means of Real-Time PCR. Using the messenger RNA isolated from exposed organisms, I analyze the changes in the expression of the genes involved in different routes of the cell and with importance in the physiology of the organism. Among the routes I study are the stress response, the synthesis and degradation of hormones, the hormone response pathways, the detoxification mechanisms, the DNA repair, and the epigenetic mechanisms. The results I get are not only interesting in toxicology but also allow us to advance in the cellular metabolism of these species at molecular level. Thanks to the massive sequencing it is possible to carry out this type of studies. From the information of transcriptome projects present in the databases and those made by members of the laboratory, genes of interest have been identified. These genes are then used to design gene panels that allow studying the effects in different cellular routes. The studies are complemented with other methodologies such as the comet assay, enzymatic activity, immunocytochemistry or Western blot. In this way it is obtained a more complete picture of the organism response and, ultimately, its ability to adapt to changes in the environment.

B. TELOMERE AND NON-CODING RNA

The telomeres of Chironomus riparius have a molecular organization different from that described in the majority of eukaryotes. As in other dipterans, more complex sequences have been found instead of the simple sequences that constitute the characteristic telomere model maintained by telomerase. The size of the repeat unit is intermediate between the telomerase-like sequences and the long retrotransposons of the Drosophila telomere. Its maintenance mechanism is unknown at the moment, so it is interesting to know if it is also based, as in the previous cases, on an intermediate RNA.

The telomeres of this organism have the additional peculiarity of being activated by heat shock and other situations of cellular stress, fact that increases the interest in its structure and function within the cellular metabolism. The sequencing of the genome of various organisms has revealed that a large proportion of it does not code for proteins. The part of the genome responsible for proteins, ribosomal RNA and transfer RNAs, accounts for only 1.5% of the total in most cases. This means that the genome is formed mostly by non-coding DNA. Recent results, obtained in recent years, show that part of the genome can hide a great diversity of genes whose final product is not a protein. A large number of RNAs are being discovered that do not give rise to proteins because they lack recognizable ORFs, called non-coding RNAs or ncRNAs, which carry out their function directly in the cell. Through bioinformatic approaches it has been estimated that their number is around several thousand in the case of eukaryotes and several hundred in the case of prokaryotes. Functionally, they have been implicated in diverse processes such as DNA replication and chromosomal maintenance, regulation of transcription, RNA processing, translation and stability of mRNAs, and even the stability and translocation of proteins. As with proteins, alterations in the control of their transcription can be the origin or serve as markers in certain processes, as has been observed in certain tumors, Alzheimer's or other diseases that affect the nervous system. In this sense, the role that these molecules can have within the processes of response to stress or exposure to environmental pollutants is to be defined.

The analysis of telomeric RNA of Chironomus riparius has a double objective. On the one hand, to know the mechanism by which telomere elongation occurs and if it implies a retrotranscription, as occurs in the two mechanisms of telomeric elongation that have been described in normal situations. The second objective is to understand the role of the telomeric transcript in cellular physiology, especially its role in the response to cellular stress, and to study its possible use as a molecular biomarker in the analysis of the response to environmental contaminants.


LÍNEAS DE INVESTIGACIÓN


(en colaboración con otros miembros del grupo de investigación)

A. ECOTOXICOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR EN INVERTEBRADOS

Dos de los problemas ambientales más importantes en el momento actual son el cambio climático y la contaminación de los ecosistemas. Las actividades humanas han modificado nuestro entorno, lo que afecta también a otros organismos. Los invertebrados son animales que carecen de columna vertebral y engloban a la mayor parte de las especies animales conocidas. Su papel en un ecosistema es básico y aparecen prácticamente en todos los lugares del planeta. Por otro lado, al ser muy diversos su respuesta a los cambios del entorno es muy variable. La toxicología es el área científica que estudia el efecto de los agentes tóxicos, tanto físicos como químicos, sobre los organismos vivos. También analiza el comportamiento de los compuestos químicos en los distintos compartimentos del ecosistema. Desde una aproximación a nivel molecular y celular dentro de esta línea estudio el efecto del multi-estrés, es decir, la respuesta de distintas especies de invertebrados al estrés químico (contaminantes) y al estrés ambiental (temperatura, pH, humedad). Las especies que estudio son Chironomus riparius (un insecto), Physella acuta (un molusco) y Eisenia fetida (un anélido). Los dos primeros son organismos que pasan la mayor parte de su vida en el agua mientras que E. fetida es una especie de lombriz de tierra. Los quironómidos son un grupo de dípteros ampliamente distribuidos que se encuentran mayoritariamente en aguas continentales, aunque existen representantes de vida marina. Dentro de su ciclo vital, el periodo larvario es el más largo y se desarrolla en los sedimentos de ríos, lagos y otras aguas continentales. Ambas características, amplia distribución y carácter bentónico, los hacen idóneos para el análisis de los efectos de compuestos contaminantes en los ecosistemas acuáticos y la búsqueda de biomarcadores moleculares útiles para la protección del medio ambiente. P. acuta es un caracol hermafrodita fácilmente cultivable que se encuentra en Europa y Norteamérica. Su ciclo vital dura aproximadamente dos años alcanzando la madurez a los dos-tres meses de eclosionar. E. fetida es una lombriz de tierra que se utiliza de forma habitual en estudios de toxicidad. También se emplea en el vermicompostaje. A partir de los capullos que forma se producen los juveniles que crecen hasta adultos una vez que desarrollan el clitelo.

Entre los compuestos que se vierten al medio existe una gran diversidad, por lo que se tiende a agrupar los mismos bien en función de los efectos que tienen (por ejemplo, disruptores endocrinos) y/o bien por su estructura (por ejemplo, polifenoles). Entre los compuestos que estoy estudiando se encuentran fungicidas (vinclozolin), plastificantes (bisfenol A), filtros ultravioletas (benzofenona-3) o metales pesados (cadmio). Se analizan tanto los efectos aislados como en mezclas de estos compuestos. Como agentes ambientales que alteran el efecto de los compuestos químicos se estudia principalmente la temperatura.

Los efectos moleculares y celulares los estudio principalmente a través del análisis de la expresión génica por medio de PCR en tiempo real. A partir del RNA mensajero aislado de organismos expuestos analizo los cambios en la expresión de los genes implicados en distintas rutas de la célula y con importancia en la fisiología del organismo. Entre las rutas que estudio se encuentran la respuesta de estrés, la síntesis y la degradación de hormonas, las rutas de respuesta de hormonas, los mecanismos de destoxificación, la reparación del DNA y los mecanismos epigenéticos. Los resultados que obtengo no solo tienen interés en toxicología sino que también permiten avanzar en el conocimiento a nivel molecular del metabolismo celular de estas especies. Gracias a la secuenciación masiva es posible realizar este tipo de estudios. A partir de la información de proyectos transcriptomas presentes en las bases de datos y de aquellos realizados por miembros del laboratorio se han identificado genes de interés que luego se utilizan para diseñar paneles de genes que permitan estudiar los efectos en distintas rutas celulares. Estos estudios se complementan con otras metodologías como el ensayo cometa, la actividad enzimática, la inmunocitoquímica o el Western blot. De esta forma se obtiene un cuadro más completo de la respuesta del organismo y, en definitiva, de su capacidad de adaptarse a los cambios de su entorno.

B. TELÓMERO Y RNA NO CODIFICANTES

Los telómeros de Chironomus riparius tienen una organización molecular diferente a la descrita en la mayoría de los eucariotas. Como en otros dípteros, se han encontrado secuencias más complejas en lugar de las secuencias simples que constituyen el modelo característico de telómero mantenido por la telomerasa. El tamaño de la unidad de repetición es intermedio entre las secuencias tipo telomerasa y los largos retrotransposones del telómero de Drosophila. Su mecanismo de mantenimiento es desconocido por el momento por lo que es de interés conocer si se basa también, como en los casos anteriores, en un RNA intermediario.

Los telómeros de este organismo tienen la peculiaridad adicional de ser activados por choque térmico y otras situaciones de estrés celular, hecho que aumenta el interés en su estructura y función dentro del metabolismo celular. La secuenciación del genoma de diversos organismos ha desvelado que una gran proporción del mismo no codifica para proteínas. La parte del genoma responsable de las proteínas, el RNA ribosómico y los RNAs de transferencia apenas supone el 1.5% del total en la mayoría de los casos. Esto significa que el genoma se forma en su mayoría por DNA no codificante. Resultados recientes, obtenidos en los últimos años, ponen de manifiesto que parte del genoma puede esconder una gran diversidad de genes cuyo producto final no es una proteína. Se están descubriendo un gran número de RNAs que no dan lugar a proteínas al carecer de ORFs reconocibles, denominados RNAs no codificantes o ncRNAs, que llevan a cabo su función directamente en la célula. Mediante aproximaciones bioinformáticas se ha estimado que su número está en torno a varios miles en el caso de eucariotas y a varios cientos en el de procariotas. Funcionalmente se han implicado en diversos procesos como la replicación del DNA y el mantenimiento cromosómico, la regulación de la transcripción, el procesado del RNA, la traducción y la estabilidad de mRNAs e incluso la estabilidad y translocación de proteínas. Al igual que ocurre con las proteínas, alteraciones en el control de su transcripción pueden ser origen o servir de marcadores en determinados procesos, como se ha observado en ciertos tumores, el Alzheimer u otras enfermedades que afectan al sistema nervioso. En este sentido, el papel que pueden tener estas moléculas dentro de los procesos de respuesta a estrés o a la exposición a contaminantes ambientales está por definir.

El análisis del RNA telómerico de Chironomus riparius tiene un doble objetivo. Por un lado, conocer el mecanismo por el cual se produce la elongación de los telómeros y si implica una retrotranscripción, como ocurre en los dos mecanismos de elongación telomérica que se han descrito en situaciones normales. El segundo objetivo es entender el papel del transcrito telomérico en la fisiología celular, especialmente su función en la respuesta a estrés celular, y estudiar su posible utilización como biomarcador molecular en el análisis de la respuesta a contaminantes ambientales.

Publicaciones de los últimos cinco años



  • Martín-Folgar R, Martínez-Guitarte JL. (2019). Effects of single and mixture exposure of cadmium and copper in apoptosis and immune related genes at transcriptional level on the midge Chironomus riparius Meigen (Diptera, Chironomidae). Sci Total Environ. 677:590-598. doi: 10.1016/j.scitotenv.2019.04.364


  • Novo M, Muñiz-González AB, Trigo D, Casquero S, Martínez-Guitarte JL. (2019). Applying sunscreens on earthworms: Molecular response of Eisenia fetida after direct contact with an organic UV filter. Sci Total Environ. 676:97-104. doi: 10.1016/j.scitotenv.2019.04.238.


  • Martínez-Paz P, Negri V, Esteban-Arranz A, Martínez-Guitarte JL, Ballesteros P, Morales M. (2019). Effects at molecular level of multi-walled carbon nanotubes (MWCNT) in Chironomus riparius (DIPTERA) aquatic larvae. Aquat Toxicol. 209:42-48. doi: 10.1016/j.aquatox.2019.01.017.


  • Aquilino M, Sánchez-Argüello P, Novo M, Martínez-Guitarte JL. (2019). Effects on tadpole snail gene expression after exposure to vinclozolin. Ecotoxicol Environ Saf. 170:568-577. doi: 10.1016/j.ecoenv.2018.12.015.


  • Muñiz-González AB, Martínez-Guitarte JL. (2018). Effects of single exposure and binary mixtures of ultraviolet filters octocrylene and 2-ethylhexyl 4-(dimethylamino) benzoate on gene expression in the freshwater insect Chironomus riparius. Environ Sci Pollut Res Int. 25(35):35501-35514. doi: 10.1007/s11356-018-3516-7.


  • Aquilino M, Martínez-Guitarte JL, García P, Beltrán EM, Fernández C, Sánchez-Argüello P. (2018). Combining the assessment of apical endpoints and gene expression in the freshwater snail Physa acuta after exposure to reclaimed water. Sci Total Environ. 642:180-189. doi: 10.1016/j.scitotenv.2018.06.054.


  • Morales M, Martínez-Paz P, Sánchez-Argüello P, Morcillo G, Martínez-Guitarte JL. (2018). Bisphenol A (BPA) modulates the expression of endocrine and stress response genes in the freshwater snail Physa acuta. Ecotoxicol Environ Saf. 152, 132-138. doi: 10.1016/j.ecoenv.2018.01.034


  • Novo M, Verdú I, Trigo D, Martínez-Guitarte JL. (2018). Endocrine disruptors in soil: Effects of bisphenol A on gene expression of the earthworm Eisenia fetida. Ecotoxicol Environ Saf. 150, 159-167. doi: 10.1016/j.ecoenv.2017.12.030


  • Martínez-Guitarte JL. (2018). Transcriptional activity of detoxification genes is altered by ultraviolet filters in Chironomus riparius. Ecotoxicol Environ Saf. 149, 64-71. doi: 10.1016/j.ecoenv.2017.11.017


  • Verdú I, Trigo D, Martínez-Guitarte JL, Novo M. (2018). Bisphenol A in artificial soil: Effects on growth, reproduction and immunity in earthworms. Chemosphere 190, 287-295. doi: 10.1016/j.chemosphere.2017.09.122


  • Martín-Folgar R, Aquilino M, Ozáez I, Martínez-Guitarte JL. (2018). Ultraviolet filters and heat shock proteins: effects in Chironomus riparius by benzophenone-3 and 4-methylbenzylidene camphor. Environ Sci Pollut Res Int. 25 (1), 333-344. doi: 10.1007/s11356-017-0416-1


  • Aquilino M, Sánchez-Argüello P, Martínez-Guitarte JL. (2018). Genotoxic effects of vinclozolin on the aquatic insect Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae). Environ Pollut. 232, 563-570. doi: 10.1016/j.envpol.2017.09.088


  • Martínez-Paz P, Morales M, Urien J, Morcillo G, Martínez-Guitarte JL. (2017). Endocrine-related genes are altered by antibacterial agent triclosan in Chironomus riparius aquatic larvae. Ecotoxicol Environ Saf. 140, 185-190. doi: 10.1016/j.ecoenv.2017.02.047


  • Martínez-Paz P, Morales M, Sánchez-Argüello P, Morcillo G, Martínez-Guitarte JL. (2017). Cadmium in vivo exposure alters stress response and endocrine-related genes in the freshwater snail Physa acuta. New biomarker genes in a new model organism. Environ Pollut. 220(Pt B), 1488-1497. doi: 10.1016/j.envpol.2016.10.012


  • Martín-Folgar R, Martínez-Guitarte JL. (2017). Cadmium alters the expression of small heat shock protein genes in the aquatic midge Chironomus riparius. Chemosphere 169, 485-492. doi: 10.1016/j.chemosphere.2016.11.067


  • Ozáez I, Aquilino M, Morcillo G, Martínez-Guitarte JL. (2016). UV filters induce transcriptional changes of different hormonal receptors in Chironomus riparius embryos and larvae. Environ Pollut. 214, 239-247. doi: 10.1016/j.envpol.2016.04.023


  • Ozáez I, Morcillo G, Martínez-Guitarte JL. (2016). Ultraviolet filters differentially impact the expression of key endocrine and stress genes in embryos and larvae of Chironomus riparius. Sci Total Environ. 557-558, 240-7. doi: 10.1016/j.scitotenv.2016.03.078


  • Aquilino M, Sánchez-Argüello P, Martínez-Guitarte JL. (2016). Vinclozolin alters the expression of hormonal and stress genes in the midge Chironomus riparius. Aquat Toxicol. 174, 179-87. doi: 10.1016/j.aquatox.2016.03.001


  • Ozáez I, Morcillo G, Martínez-Guitarte JL. (2016). The effects of binary UV filter mixtures on the midge Chironomus riparius. Sci Total Environ. 556, 154-62. doi: 10.1016/j.scitotenv.2016.02.210


  • Martín-Folgar R, de la Fuente M, Morcillo G, Martínez-Guitarte JL. (2015). Characterization of six small HSP genes from Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae): Differential expression under conditions of normal growth and heat-induced stress. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 188, 76-86. doi: 10.1016/j.cbpa.2015.06.023